کلونینگ و بیان بخش‌های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A …

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک… 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری.. 11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها 11

2-3-2 میکروبیولوژی.. 12

2-3-3 ژنوم13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی.. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17

2-3-9 سرطان18

2-3-10 آسیب شناسی.. 19

2-3-11 پیشگیری.. 19

2-3-12 درمان20

2-3-13 پیش بینی بیماری.. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology)24

2-4 آنتی ژن‌ها 25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن25

2-5 اپی توپ‌ها 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها 26

2-5-2 عملکرد27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27

2-5-3 واکنش متقاطع.. 28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده 38

2-7-1 دات بلاتینگ… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench538

2-7-3 نرم افزار Mega539

2-7-4 ابزار BLAST.. 39

3 مواد و روش‌ها 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده 42

3-5 طراحی آغازگرها 42

3-6 انجام واکنش PCR.. 43

3-7 خالص سازی محصول PCR.. 44

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M)46

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml)46

3-8-5 محیط کشت LB مایع.. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد47

3-9-2 هضم pET-32a  (+)49

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+)50

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب… 53

3-9-10 کلونی PCR.. 53

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)56

3-12 تحریک بیان ژن هدف… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد: 59

3-15 دات بلات… 61

3-16 محلولها و بافرها 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS62

3-16-2 محلول بلوکه کننده 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی.. 65

3-19-1 تزریق اولیه: 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection)66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700.. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات… 67

4 نتایج و بحث… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T774

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن78

4-15 SDS-PAGE78

4-16 دات بلات… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات… 85

فهرست شکل‌ها

          عنوان                                                                                                    صفحه

شکل 4-1.  نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف… 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با استفاده از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ  82

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                          صفحه

جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش…. 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59

فهرست علائم و اختصارات

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

پایان نامه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


یک مطلب دیگر :


پایان نامه سنجش کیفیت زندگی:


معادل فارسی معادل لاتین علامت اختصاری
     
آدنوزین دی فسفات Adenosine 5’-Diphosphate

ADP 

 

آدنوزین تری فسفات Adenosine 5’-Triphosphate ATP
جفت باز Base pair bp
سرم البومین گاوی Bovain serum albumin BSA
دی آمینو بنزیدین Diamino Benzidine DAB
آب دوبار تقطیر Double Distilled Water ddW
اسید دزوکسی ریبو نوکلئیک Deoxyribonocleic Acid DNA
اتیلن دیامین تترا- استیک اسید Ethylenediaminetetra-acetic acid EDTA
سازمان امنیت محصولات غذایی Generally Regarded As Safe GRAS
ایمنو گلوبین Y Immunoglobulin Y IgY
ایمنوگلوبین E Immunoglobulin E IgE
ایمنوگلوبین G Immunoglobulin G IgG
میواینوزیتول هگزاکیس فسفات myo-Inositol Hexakisphosphate Ins P6
اینوزیتول پلی فسفات­ها Inositol Poly Phosphates IPPs
تیوگالاکتوپیرانوزید ایزوپروپیل Isopropyl β -D-thiogalactopyranoside IPTG
اتحادیه بین الملل شیمی خالص و کاربردی- اتحادیه بین المللی بیوشیمی International Union of Pure and Applide Chemistry- International Union of Biochemistry

IUPAC- 

IUB

کیلوباز Kilobase  (pair) kb
کیلودالتون kiloDalton kDa
لوریا- برتانی Lauria – Bertani LB
بانک جهانی اطلاعات بیوتکنولوژی National Center of Biotechnology Information NCBI
چگالی نوری Optic Density OD
چارچوب خواندن آزاد Open Reading Frame ORF
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction PCR
پروتئین تیروزین فسفات Protein Tyrosine Phosphatase PTP
پلی اتیلن گلایکول Polyethylene glycol PEG3
جایگاه اتصال ریبوزوم Ribosomal Binding Site RBS
دور در دقیقه Round per minute rpm

سدیم دودسیل سولفات – 

ژل الکتروفورز پلی­اکریل آمید

Sodium Dodecyl Sulfate – 

Be the first to comment

Leave a Reply

ایمیل شما نمایش داده نخواهد شد


*